Desarrollo de uno

Dec 20, 2023

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 3427 (2022) Citar este artículo

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Se desarrolló un método de análisis de un solo paso para cuatro tipos de aminoácidos utilizando un dispositivo analítico de microfluidos basado en papel fabricado a partir de papel de filtración para cromatografía y películas laminadas. Se utilizó aminoacil-ARNt sintetasa para detectar cada aminoácido. El dispositivo analítico basado en papel laminado (LPAD) obtenido contenía cuatro áreas de reacción enzimática. La detección colorimétrica se realizó basándose en la reacción del azul de molibdeno. Se sugirió un método modelo para la detección simple, fácil y simultánea de varias concentraciones de aminoácidos, en contraste con los métodos convencionales como HPLC o LC-MS. El método proporcionó una cuantificación selectiva en los rangos de 3,6 a 100 μM para triptófano, 10,1 a 100 μM para glicina, 5,9 a 100 μM para histidina y 5,6 a 100 μM para lisina con un límite de detección de 1,1 μM, 3,3 μM, 1,9 μM. y 1,8 µM, respectivamente. La fabricación de LPAD fue considerablemente simple y el proceso de detección posterior fue sencillo y requirió un corto período de tiempo (en 15 minutos).

Los dispositivos analíticos en papel (PAD) exhiben características importantes, como su diseño simple y fácil para la fabricación de la forma y longitud del camino de microfluidos, la necesidad de una fuente de energía externa y su rentabilidad. Los PAD han atraído una intensa atención de la investigación como plataformas analíticas1,2,3,4,5. Aunque la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se utiliza generalmente para analizar compuestos biológicos, requiere mucho tiempo y es costosa6. Otros grupos de investigación han informado previamente sobre el uso de PAD para analizar compuestos biológicos. Por ejemplo, Huang desarrolló un método de tinción con platino para la mioglobina como compuesto modelo, en el que la superficie de oro coloidal se recubría con nanocásulas de platino y se evaluaba mediante una tira reactiva, como el reactivo utilizado en las pruebas de embarazo. Lograron desarrollar un método de detección cuantitativa sensible para la mioglobina basado en altos niveles de actividad catalítica7. Otro ejemplo son las tiras de gel de sílice que se han desarrollado para la detección de iones Fe (III). Las tiras de sílice estaban impregnadas con tanino y, debido a la unión selectiva del tanino al Fe (III), la detección colorimétrica de Fe (III) se pudo realizar mediante inspección visual, utilizando antocianina, un tinte rojo extraído de la col8,9,10. . Como las tiras reactivas de papel pueden fabricarse a bajo coste, podrían suministrarse fácilmente en grandes cantidades para controles médicos y evaluaciones de fármacos11.

El contenido de aminoácidos libres en el suero sanguíneo sirve como indicador de enfermedades como cáncer, enfermedades hepáticas y diabetes; de ahí que se consideren útiles en el diagnóstico clínico12,13. Anteriormente analizamos un nuevo sistema de análisis de aminoácidos utilizando aminoacil-ARNt sintetasa (aaRS) como elemento de reconocimiento molecular14,15,16,17,18,19. Los aaRS existen para cada uno de los 20 aminoácidos correspondientes y participan en la biosíntesis de proteínas y péptidos en el cuerpo. Por tanto, aaRS podría servir como material de reconocimiento para el análisis de aminoácidos20,21,22,23.

En este estudio se utilizaron cuatro aminoácidos, triptófano, glicina histidina y lisina, como aminoácidos modelo debido a su potencial diagnóstico para varios trastornos y su importancia metabólica. La síntesis de serotonina a partir de triptófano está inhibida en pacientes con depresión; por lo tanto, la medición de los niveles de triptófano podría tener un uso potencial para el diagnóstico de esta condición24. La glicina es un componente básico de diversas biomoléculas como el glutatión, los derivados de purina y las hemoproteínas. Además, se ha informado que la ingesta de glicina mejora la calidad del sueño25. La histidinemia es una enfermedad hereditaria caracterizada por concentraciones plasmáticas anormales de histidina que pueden provocar deterioro intelectual26. La lisina, uno de los aminoácidos esenciales, está asociada a la mejora del equilibrio nutricional del cuerpo humano27.

En este estudio, se fabricó un PAD laminado (LPAD) para triptófano, glicina histidina y lisina con un área de reacción enzimática correspondiente al área de detección. Este LPAD proporcionó la detección simple, fácil y simultánea de las concentraciones de varios aminoácidos, a diferencia de los métodos convencionales como HPLC o LC-MS. La detección colorimétrica se realizó basándose en la reacción del azul de molibdeno. Triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS; aaRS específica de triptófano), glicil-ARNt sintetasa (GlyRS; aaRS específica de glicina), histidil-ARNt sintetasa (HisRS; aaRS específica de histidina) y lisil-ARNt sintetasa (LysRS; específica de lisina) aaRS) se utilizaron para los elementos de reconocimiento de cada aminoácido. Se determinaron las condiciones analíticas y el rango de concentración detectable para cada aminoácido.

En este sistema, aaRS primero reconoce su aminoácido correspondiente en presencia de adenosina 5′-trifosfato (ATP), y luego se liberan aminoacil-AMP y pirofosfato (Ec. 1). El pirofosfato resultante reacciona con molibdato de amonio y 2-mercaptoetanol, que normalmente se utilizan para la detección y medición de fosfato (Ec. 2)23. Finalmente, se cuantifica el tono azul resultante y se calculan las concentraciones de aminoácidos19.

Los aminoácidos, el cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2 · 6H2O), el molibdato de amonio, el 2-mercaptoetanol, el ácido clorhídrico, el ácido sulfúrico y el hidrogenocarbonato de sodio se adquirieron de Wako Pure Chemicals (Osaka, Japón). Tris (hidroximetil) aminometano y ATP se adquirieron de Sigma-Aldrich Japan (Tokio, Japón). El papel de filtración Advantec N° 1 y N° 5B se obtuvo de Toyo Roshi Kaisha, Ltd. (Tokio, Japón), y un papel de filtración MN616G se obtuvo de Macherey-Nagal Co. Ltd. (Duren, Alemania), mientras que los de 75 µm - Se adquirió una película gruesa de poliéster para bolsa de unión térmica de ACCO Brands Corp. (Tokio, Japón). TrpRS, GlyRS, HisRS y LysRS se encargaron a Ikeda Tohka Industries Co., Ltd. (Hiroshima, Japón). Los productos químicos eran reactivos comerciales de la más alta calidad y se utilizaron sin purificación adicional.

El LPAD se fabricó utilizando casi el mismo procedimiento que en nuestro estudio anterior19: el patrón LPAD se diseñó utilizando el software controlador de un cortador artesanal (Graphtec CE6000-40 Cutting Plotter, Graphtec Corporation, Kanagawa, Japón). Se fijó un papel de filtración a una hoja portadora adhesiva y se cortó usando el trazador de corte. Se obtuvieron tiras de papel después de eliminar los bordes no deseados. También se fabricó el patrón recortado para la portada. El diseño se exportó al cortador artesanal y la película de cubierta se cortó de la misma manera que el papel. Después del corte, la tira de papel de cubierta y la hoja inferior se alinearon y ensamblaron, como se muestra en la Fig. 1a. El conjunto se pasó a través de un laminador calentado a 100 °C (Laminador B35A3, CBC Acco Brands; Tokio, Japón). Una vez laminadas las películas de poliéster, se adaptaron al contorno de la tira de papel. Mientras que la Fig. 1b muestra una ilustración del dispositivo fabricado, la Fig. 1c muestra los tamaños de las vías de microfluidos. Se fabricaron varias combinaciones de las longitudes de los caminos entre el área de reacción enzimática y el área de detección (10 a 20 mm) y el ancho de los caminos (1,0 a 3,0 mm) y se evaluó y optimizó la respuesta.

Fabricación del dispositivo analítico en papel laminado (LPAD). (a) Los canales de papel diseñados se intercalaron entre la cubierta y las películas laminadas inferiores, se alinearon y se ensamblaron. El conjunto se pasó a través de un laminador calentado. La ilustración fue dibujada con “Rhinoceros ver. Software CAD 3D de 6”28. (b) Una ilustración del dispositivo fabricado. (c) Dimensiones de las rutas de microfluidos del LPAD. Se fabricaron varias longitudes y anchos de camino entre el área de reacción enzimática y el área de detección. La longitud optimizada fue de 15 mm y la anchura de 3,0 mm.

Determinamos que el tamaño optimizado era de 15 mm para la longitud del camino entre el área de reacción enzimática y el área de detección, y el mejor ancho del camino era de 3,0 mm. El papel de filtración Advantec No. 1 fue el papel de filtración preferido para el LPAD. A continuación, se emplearon los LPAD optimizados para los siguientes ensayos.

Para preparar el área de reacción enzimática en el LPAD, se dispensaron TrpRS, GlyRS, HisRS y LysRS en una concentración de 50 μM (1,0 μL) (Fig. 2). En las áreas de detección de aminoácidos en el LPAD, se dispensó cada solución de molibdato de amonio al 5% en ácido sulfúrico 2,5 M (0,5 μL) y se dejó secar a 25 °C durante 30 minutos. El dispositivo se almacenó durante la noche a 4ºC.

Protocolo de ensayo. Cada triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS), glicil-ARNt sintetasa (GlyRS), histidil-ARNt sintetasa (HisRS) y lisil-ARNt sintetasa (LysRS) se distribuyó en cada área de reacción enzimática. Se distribuyó cinco por ciento de molibdato de amonio en ácido sulfúrico 2,5 M en el área de detección. La solución del analito se cargó en el punto de muestra del LPAD, y el área del punto y las áreas de reacción enzimática se calentaron a 60 °C usando un bloque calefactor de aluminio.

Las soluciones de analitos se prepararon disolviendo cada solución de aminoácidos en diversas concentraciones (0–100 μM). Posteriormente, cada solución de aminoácidos se combinó con una solución recién preparada de ATP (5,0 mM), cloruro de magnesio (MgCl2) (5,0 mM) y 2-mercaptoetanol (1,0 M) en tampón Tris-cloruro de hidrógeno (pH 8,0, 100 mM). , volumen total = 40 μL) (Fig. 2).

La solución de analito (40 µl) se cargó en el punto de muestra del LPAD. El área puntual y las áreas de reacción enzimática se calentaron hasta 60 °C usando un bloque calefactor de aluminio. Después de una incubación durante 15 minutos para asegurar tiempo suficiente para la interacción con el pirofosfato y los reactivos de color, se dejó que la solución fluyera a través de las tiras de papel. Para cuantificar los resultados, se adquirieron imágenes de los dispositivos de papel utilizando un escáner de imágenes (ES-H7200; Seiko Epson Corporation, Suwa, Nagano, Japón). Las imágenes en color de 600 ppp (24 bits) se analizaron utilizando el software ImageJ versión 1.4929 y se utilizó el comando adjunto para igualar el color del fondo de la tira de papel. Se guardaron las imágenes y los colores de sus áreas de detección se invirtieron utilizando el Programa de manipulación de imágenes GNU para convertir la intensidad del azul del LPAD en brillo. Luego se midieron las áreas de brillo y detección utilizando el software ImageJ. La señal de integración con una unidad arbitraria se obtiene multiplicando el brillo y el área de detección. Se definió evaluar el progreso de las reacciones enzimáticas y colorimétricas en las Ecs. (1) y (2).

En nuestro LPAD previamente informado para histidina, era necesario realizar la reacción enzimática fuera del LPAD: la mezcla de reacción con HisRS, histidina, ATP y MgCl2 en un microtubo se calentó usando un bloque calefactor de aluminio a 80 °C durante 30 min y enfriado en hielo durante 5 min. Posteriormente, la mezcla de reacción se cargó en el LPAD. Fue necesario el paso facticio con calentamiento de la mezcla de reacción y pipeteo de la muestra19. En este estudio, se utilizó un LPAD que funciona consecutivamente para reacciones enzimáticas y colorimétricas en un solo paso.

La reacción enzimática ocurre cuando la mezcla de reacción enzimática penetra el área de detección; en consecuencia, el tiempo de reacción enzimática es importante y afectará la respuesta de LPAD. El tipo y la forma de los papeles de filtración utilizados para los microfluidos se evaluaron utilizando Advantec Grado No. 1, Advantec Grado No. 5B y MN616G. La Tabla 1 muestra los conjuntos de longitudes entre las áreas de detección y reacción enzimática y el ancho de los caminos de microfluidos. Se determinó que una longitud entre las áreas de reacción enzimática y detección de 15 mm y un ancho de los caminos de microfluidos de 3,0 mm era el tamaño preferido para el LPAD. Un camino de longitud corta y/o ancho estrecho no mostró ninguna respuesta o solo una respuesta escasa ya que la mezcla de reacción alcanzó el área de detección instantáneamente. Si la longitud fuera mayor (20 mm), la mezcla de reacción enzimática cargada no podría alcanzar el área de detección. Por lo tanto, es importante considerar la provisión de tiempos de reacción enzimática de aaRS suficientes durante la penetración de la mezcla de reacción en el papel de filtración al diseñar LPAD. La densidad de la fibra del papel de filtración también es un factor importante. El papel de filtración de alta densidad Advantec Grado No. 1 mostró mejor desempeño en el punto de densidad de fibra debido a que la mezcla de reacción penetró gradualmente y esto fue suficiente para los tiempos de reacción enzimática. Los papeles de filtración de alta densidad también retuvieron suficientemente las soluciones de enzimas y reactivos para permitir la reacción enzimática en el área de detección, lo que indica que la fabricación estable de LPAD podría ser posible. Además, en el punto de la detección colorimétrica que se realizó basándose en la reacción del azul de molibdeno, la profundidad del color cambió de manera dependiente del tiempo y se saturó. Se prefirió la evaluación del color de las áreas de detección 15 minutos después de la deposición de las muestras (datos no mostrados).

En la Fig. 3a se muestran las fotografías obtenidas después de analizar el LPAD usando 0–100 μM para cada aminoácido. El color del área de detección de LPAD para glicina (esquina superior derecha del LPAD) después de cargar glicina cambió de amarillo a azul, mientras que las áreas de detección de triptófano (esquina superior izquierda), histidina (esquina inferior izquierda) y lisina (esquina inferior derecha). esquina) después de la carga de glicina no mostró cambios de color. De la misma manera, el color del área de detección de LPAD cuando solo se cargaron triptófano, histidina o lisina respectivamente, cambió de amarillo a azul y no se observaron reacciones para los aminoácidos discordantes.

Fotos de los dispositivos analíticos en papel laminado (LPAD) después de la carga de cada aminoácido. (a) Imagen original de cada LPAD después de la interacción con triptófano, glicina, histidina y lisina de 0 a 100 μM. Se observó cambio de color sólo en el área de detección del aminoácido sustrato. (b) Las imágenes se invirtieron en color utilizando el programa de manipulación de imágenes GNU.

Las imágenes invertidas obtenidas utilizando el programa de manipulación de imágenes GNU se muestran en la Fig. 3b.

La Figura 4 muestra las curvas de calibración para la detección de triptófano, glicina, histidina y lisina (círculo relleno en cada gráfico). El eje horizontal representa la concentración inicial de cada aminoácido y el eje vertical representa la señal de integración (unidad arbitraria), que se calcula como el producto del brillo y el área de detección. La señal de integración aumentó en respuesta a la adición de aminoácidos del sustrato, y se obtuvieron buenos rangos de linealidad entre 3,6 y 100 μM para triptófano, con un límite de detección de 1,1 μM (r = 0,9717, Fig. 4a), 10,1–100 μM para glicina. , con un límite de detección de 3,3 μM (r = 0,9722, Fig. 4b), 5,9–100 μM para histidina, con un límite de detección de 1,9 μM (r = 0,9816, Fig. 4c) y 5,6–100 μM para lisina. con un límite de detección de 1,8 μM (r = 0,9756, Fig. 4d).

Curvas de calibración para detección de triptófano, glicina, histidina y lisina. El círculo relleno en cada gráfico representa el aminoácido sustrato, mientras que los círculos abiertos indican el promedio de las señales de integración de tres aminoácidos que no son sustrato. Los datos representan el promedio de tres mediciones y las barras de error indican desviaciones estándar.

El límite de detección (LOD) del HPLC convencional (Hitachi Amino Acid Analyser L-8900) es de aproximadamente 0,5 μM6 y ligeramente superior al LOD de nuestro LPAD. Sin embargo, las concentraciones mensurables de cada aminoácido de los LPAD estaban dentro del rango aproximado de los niveles de aminoácidos encontrados en la sangre.

La Figura 4 también muestra la selectividad del LPAD. Los círculos abiertos en cada gráfico representan el promedio de la señal de integración de tres aminoácidos que no son sustrato; El círculo abierto en la Fig. 4a (área de detección de triptófano) indica el promedio de la señal de integración de histidina, lisina y glicina. Cada curva de calibración no era inclinada y los valores eran casi los mismos que los del aminoácido sustrato 0 µM; por lo tanto, no se observó respuesta para los aminoácidos que no son sustrato. Debido a las especificidades de sustrato de TrpRS, GlyRS, HisRS y LysRS, estas enzimas se unen específicamente a sus aminoácidos sustrato correspondientes. Por tanto, el LPAD podría analizar selectivamente los aminoácidos. En nuestro artículo anterior, no se observó interferencia en la unión del aminoácido sustrato a aaRS. La actividad de unión de aaRS al aminoácido sustrato único y a la mezcla de 20 aminoácidos fue casi del mismo valor; por lo tanto, la existencia de otros 19 aminoácidos en la mezcla de reacción no interferiría en la unión del aminoácido sustrato a aaRS14.

Se evaluó la reproducibilidad de las respuestas de LPAD a 100 μM de cada aminoácido entre tres fechas de ensayo y fabricación diferentes (3 días) (Tabla 2). Cada entrada se repitió tres veces. El coeficiente de variación [CV (%)] fue aproximadamente inferior al 2% y los valores de CV fueron bajos. Estos hallazgos sugieren que la fabricación de los LPAD, incluido el corte de los papeles y películas de filtración, así como el recubrimiento de los reactivos, se puede reproducir de manera precisa y consistente. Los LPAD mostraron suficiente reproducibilidad para cada aminoácido. Además, como se describió anteriormente, solo requirieron varios micromoles de cada aminoácido para funcionar, y esto es consistente con los niveles de aminoácidos en la sangre.

Se fabricó un dispositivo de análisis de un solo paso, LPAD, para triptófano, glicina, histidina y lisina, utilizando papeles de filtración para cromatografía y películas laminadas. Al fabricar LPAD, descubrimos que las longitudes entre las áreas de detección y reacción enzimática y el ancho de los caminos de microfluidos eran importantes para garantizar tiempos de reacción enzimática suficientes. El papel de filtración de alta densidad funcionó como un sensor eficaz, permitiendo tiempos de reacción enzimática suficientes al retener las enzimas y los reactivos en las áreas de detección y reacción enzimática.

El método de fabricación fue sencillo y sólo implicó el corte artesanal de dos materiales a un costo muy bajo de aproximadamente 2 dólares estadounidenses. Por lo tanto, los LPAD podrían fácilmente producirse en grandes cantidades para controles médicos y evaluaciones de medicamentos en el futuro11.

Las respuestas colorimétricas podrían detectar selectivamente triptófano, glicina, histidina y lisina, en concentraciones que varían desde varios micromolares hasta 100 μM. El LPAD sugerido en este estudio mostró LOD relativamente buenos en comparación con los obtenidos mediante métodos de HPLC convencionales, y las concentraciones mensurables de cada aminoácido de los LPAD estaban dentro del rango aproximado de niveles de aminoácidos encontrados en la sangre. Además, el tiempo de análisis utilizando el LPAD fue de sólo 15 minutos, mientras que el método HPLC requiere aproximadamente 150 minutos para un análisis. En estudios futuros, planeamos examinar si el ensayo se puede utilizar para muestras reales de sangre o suero.

Dispositivo analítico basado en papel laminado

Dispositivo analítico en papel

Aminoacil-ARNt sintetasa

Triptofanil-ARNt sintetasa

Glicil-ARNt sintetasa

Histidil-ARNt sintetasa

Lisil-ARNt sintetasa

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Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación del Centro Regional de Investigación de Innovación de Chugoku y también por la Fundación Técnica Satake. Nos gustaría agradecer a Editage (www.editage.com) por la edición en inglés.

Departamento de Ciencias de la Información Biomédica, Escuela de Graduados en Ciencias de la Información, Universidad de la Ciudad de Hiroshima, 3-4-1 Ozuka-higashi, Asaminami-ku, Hiroshima, 731-3194, Japón

Akimitsu Kugimiya, Sho Wakimoto, Jiro Kohda, Yasuhisa Nakano y Yu Takano

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AK planificó, diseñó y supervisó el estudio. SW realizó experimentos y analizó los datos. JK, YN e YT brindaron asesoramiento científico y revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Akimitsu Kugimiya.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Kugimiya, A., Wakimoto, S., Kohda, J. et al. Desarrollo de un método de análisis de un solo paso para varios aminoácidos utilizando un dispositivo analítico de microfluidos basado en papel. Informe científico 12, 3427 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-07408-9

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Recibido: 29 de noviembre de 2021

Aceptado: 18 de febrero de 2022

Publicado: 02 de marzo de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-07408-9

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